由于miRNA(microRNA)分子序列較小，僅20nt左右，沒(méi)有真核生物的Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，采用傳統(tǒng)Oligo dT引物和隨機(jī)引物很難獲得從miRNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前普遍采用的解決方案有兩種：特異性反轉(zhuǎn)錄引物（圖1A所示）、兩步加A法反轉(zhuǎn)錄方案（圖1B所示）。

本公司開(kāi)發(fā)出一套全新的一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，基于Peter改良的miR-Q技術(shù)，可以對(duì)成熟的miRNA同時(shí)完成Poly(A)反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，直接獲得含有特異性tag和15(T)的cDNA產(chǎn)物（如圖2所示）。該方法使得miRNA反轉(zhuǎn)錄與mRNA的反轉(zhuǎn)錄一樣輕松,直接將提取的microRNA與反應(yīng)緩沖液混合物混合并置于PCR儀上1小時(shí)即可獲得高濃度的、包含所有miRNA分子的cDNA產(chǎn)物,獲得的cDNA產(chǎn)物適合于采用SYBR Green染料法進(jìn)行RealTime PCR進(jìn)行定量檢測(cè)。

一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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