總蛋白(Total Protein,TP)由白蛋白和球蛋白組成，對于生物體液(血清、尿液、腦脊液)中總蛋白質(zhì)含量的測定，一般要基于

如下兩個假設(shè)：1、所有蛋白質(zhì)分子由純多肽組成，含氮量的質(zhì)量百分比為16%；2、體液中含有數(shù)百個蛋白質(zhì)分子，

每個分子對測定反應(yīng)都具有非常相似的特性，目前常用的檢測總蛋白的方法有：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法

、凱氏定氮法、沉淀法等。

總蛋白(雙縮脲比吸光度微板法)多用于人或動物血清、血漿、組織等樣本中的總蛋白含量測定，雙縮脲反應(yīng)的原理是在呈藍色的堿性硫酸銅溶液存在

的情況下，肽鍵與銅離子結(jié)合，生成藍紫色的化合物，此化合物在540nm的吸光度與肽鍵的數(shù)量呈正比例關(guān)系，

因此可計算出蛋白質(zhì)的含量，雙縮脲法測蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，但易受銅離

子螯合劑的影響，另外對于血清總蛋白的雙縮脲分析，脂類、血紅蛋白、葡聚糖具有一定干擾作用，

雙縮脲法在5～160mg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

1、取內(nèi)徑為8mm的玻璃試管2支，分別加入白陶土-腦磷脂混懸液0.2ml。

2、靜脈采血1ml，立即取下針頭，沿管壁向各試管注入血液0.5ml，立即混勻并啟動秒表計時，并置于37℃水浴中。

3、每隔10s輕搖試管一次，觀察管內(nèi)血液流動情況，直至血液凝固。記錄血液凝固所需時間，即為ACT。

4、取2支試管血液凝固時間的平均值作為ACT 值。

計算：參考區(qū)間： (1.77±0.76)min

4、配制標準品工作液︰如果檢測血清、尿液等樣品，按取丙酮酸標準(6mg/ml):蒸餾水=1：99的比例配制，使?jié)舛冗_到60μg/ml，如果檢測組織樣品按丙酮酸標準(6mg/ml) :組織勻漿液(1×)=1:99的比例配制，使?jié)舛冗_到60μg/ml。

注意事項:

1、實驗材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即使用，應(yīng)存于-20°C.

2、實驗用蒸餾水不能含有二氧化碳，可用新煮沸且冷卻后的蒸餾水，并蓋緊口。

3、TA滴定液為堿性溶液，有腐蝕性，請小心操作。

4、TA標定液容易長菌，宜4℃保存，一旦發(fā)現(xiàn)有絮狀物請棄用。

5、果實中含酸量較少時可將TA滴定液適當稀釋后使用，可考慮用0.01~0.05M  TA滴定液進行滴定。

6、TA滴定液含量計算公式中，V0最好為3次空白測定的平均值。

7、如果所測樣品的濃度過高，應(yīng)用TA Lysis Buffer工作液稀釋樣品后重新測定，并將稀釋倍數(shù)帶入公式。

8、如果樣品顏色較深，滴定終點不易觀察，應(yīng)采用電位滴定法。

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